半乳糖苷酶

半乳糖苷酶是指一類水解含半乳糖苷鍵物質(zhì)的酶類，如乳糖（乳糖為一分子葡萄糖與一分子半乳糖經(jīng)脫水縮合形成的二糖）。主要分為α-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶。α-半乳糖苷酶催化α-半乳糖苷鍵的水解，可將飼料及豆制食品中的抗?fàn)I養(yǎng)因子α-半乳糖苷類轉(zhuǎn)化分解，改善其營養(yǎng)成分。此外，該酶在制藥、增稠劑處理和造紙工業(yè)也有一定應(yīng)用。β-半乳糖苷酶不僅在食品工業(yè)中的用途越來越廣泛，在生物技術(shù)領(lǐng)域如基因工程、酶工程、蛋白質(zhì)工程等方面也都發(fā)揮著重要作用，并開始廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥等領(lǐng)域。

α-半乳糖苷酶（α-galactosidase，α-gal，EC 3.2.1.22）是催化α-半乳糖苷鍵水解的一種外切糖苷酶，因能分解蜜二糖，又稱蜜二糖酶，它能催化α-半乳糖苷鍵的水解。這一特點(diǎn)使得它可用于改善和消除飼料及豆制食品中的抗?fàn)I養(yǎng)成分。此外，它在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中能實(shí)現(xiàn)B→O血型轉(zhuǎn)變、制備通用型血，以及在法布里病的酶替代治療中也發(fā)揮了重要作用。α-半乳糖苷酶還可作用于含α-半乳糖苷鍵的復(fù)合多糖、糖蛋白和鞘糖。某些α-半乳糖苷酶在底物濃度高度富集的情況下還具有轉(zhuǎn)半乳糖基作用，利用這一特點(diǎn)可用于低聚糖的合成及制備環(huán)糊精衍生物。開發(fā)嗜中性或具pH 穩(wěn)定性的α-半乳糖苷酶，尋找高產(chǎn)酶量的微生物或植物，成為近幾年的研究熱點(diǎn)。許多耐熱α-半乳糖苷酶也因其特殊性逐漸引起了科學(xué)家們的廣泛興趣，期望利用其熱穩(wěn)定性在工業(yè)方面發(fā)揮更大的利用價(jià)值，以及在科技工藝和醫(yī)藥領(lǐng)域顯示出更廣闊的應(yīng)用前景  。

α-半乳糖苷酶廣泛存在于植物、微生物及動(dòng)物中，屬于糖苷水解酶第26和37家族。其中，第26家族的α-半乳糖苷酶只來源于真核生物，而第37家族的α-半乳糖苷酶則主要來源于原核生物。根據(jù)酶活和最適pH，α-半乳糖苷酶有酸性和堿性之分。對(duì)于植物來源的α-半乳糖苷酶的研究比較多，在植物種子、果實(shí)、葉子和塊莖中都發(fā)現(xiàn)了該酶，且來源于種子和葉子的多是酸性α-半乳糖苷酶，屬于糖苷水解酶第27家族。堿性α-半乳糖苷酶多具有合成酶作用，且屬于糖苷水解酶第36家族。植物中研究的α-半乳糖苷酶有咖啡豆、無花果、豆芽、椰子、芋頭塊莖、黃瓜、葡萄、水稻、木瓜等；種子中有大豆、斑豆、蕃茄等；細(xì)菌中有鏈霉菌、脆弱芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、發(fā)酵乳桿菌、嗜熱絲袍菌、雙歧桿菌等；真菌中有葡酒色被孢霉、根霉、產(chǎn)紫青霉、里氏木霉、煙曲霉、草酸青霉、寄生曲霉、黑曲霉、臭曲霉、分枝犁頭霉、米曲霉等。在各種哺乳動(dòng)物組織的勻漿中也存在α－半乳糖苷酶，人和鼠的甲狀腺、腎臟和脾臟酶的活性最高。隨著分離純化技術(shù)的發(fā)展，得到了越來越多的純化酶，分子生物學(xué)的迅速發(fā)展也為α-半乳糖苷酶的研究開創(chuàng)了新的領(lǐng)域。通過基因工程技術(shù)，人們已經(jīng)從動(dòng)物器官、植物、細(xì)菌和真菌等生物體中克隆出許多α-半乳糖苷酶基因，許多α-半乳糖苷酶也因其耐熱性而受到越來越多的關(guān)注。來源于布氏棲熱菌的α-半乳糖苷酶能耐受的最高溫度達(dá)93 ℃；從嗜熱脂肪芽孢桿菌分離純化α-半乳糖苷酶的最適溫度為65℃。已研究較多的是具有熱穩(wěn)定性的α-乳糖苷酶菌株和嗜熱菌、耐熱梭狀芽孢桿菌等。這些從嗜熱或耐熱微生物中獲得的熱穩(wěn)定α－半乳糖苷酶可解決其應(yīng)用過程中存在的熱不穩(wěn)定性問題，對(duì)該酶的推廣和使用具有重要意義 。

α-半乳糖苷酶的催化作用是移除底物末端α-連接的非還原性D-半乳糖，或通過轉(zhuǎn)糖基作用將半乳糖基團(tuán)以α-1,6糖苷鍵轉(zhuǎn)移到受體C6位的羥基上。含有這一類糖苷鍵的底物和受體在自然界中分布廣泛，因此，α-半乳糖苷酶在工業(yè)、食品、醫(yī)療和科學(xué)研究中有著廣泛的應(yīng)用，被認(rèn)為是最有應(yīng)用潛力的酶制劑之一。

玉米—豆粕型飼料因具有粗蛋白質(zhì)含量高、氨基酸含量平衡且富含賴氨酸等營養(yǎng)特點(diǎn)，是很好的蛋白質(zhì)飼料來源。但豆粕及雜粕類飼料中α-半乳糖苷糖類含量相對(duì)較高，在飼料中是一種抗?fàn)I養(yǎng)因子，簡(jiǎn)單的加工方法難以將其分解，且單胃動(dòng)物不能分泌消化該類物質(zhì)的酶，只有通過微生物發(fā)酵后才能利用寡聚糖，而產(chǎn)生的揮發(fā)性脂肪酸和各種氣體均能使動(dòng)物腸胃脹氣、腹痛、腹瀉、惡心和厭食等。另外，這些低聚糖還能刺激腸道蠕動(dòng)、提高飼料通過消化道的速度、減少食糜在消化道停留的時(shí)間，從而影響營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收用棉籽糖類喂養(yǎng)老鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多數(shù)老鼠發(fā)生腹瀉，同時(shí)還在排泄物中發(fā)現(xiàn)了棉籽糖的殘留物，于是首次提出了α-半乳糖苷的抗?fàn)I養(yǎng)作用，之后進(jìn)一步的研究相繼證實(shí)這一結(jié)果。α-半乳糖苷被認(rèn)為是動(dòng)物攝入飼料之后引起腸道腹脹的主要因素；試驗(yàn)結(jié)果表明，豆科植物中α-半乳糖苷的量與腸道產(chǎn)氫量呈正相關(guān)，因此，分解去除飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子α－半乳糖苷顯得尤為重要。在飼料中添加外源α-半乳糖苷酶制劑，可專一性的催化水解α-1，6糖苷鍵，使α-半乳糖苷分解得到低聚寡糖和單糖。研究結(jié)果表明，與未經(jīng)處理的豆粕相比，用α-半乳糖苷酶處理后的豆粕飼喂雞可使糞便中棉籽糖和水蘇糖分別減少69%和54%，凈代謝能和生長性能都有明顯增加（P<0.05）；以α-半乳糖苷酶為主的復(fù)合酶添加于肉雞玉米—豆粕型日糧中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)飼料的效率提高了1%～10%，胴體產(chǎn)量提高了10%～20%，腹脂率降低了10%～20%，這表明α-半乳糖苷酶將抗?fàn)I養(yǎng)因子消除之后，提高了營養(yǎng)物質(zhì)分配效率；類胰島素生長因子（IGF-I）分泌不受抑制，可節(jié)省蛋白質(zhì)合成氨基酸，從而提高瘦肉率，降低飼料成本；在基礎(chǔ)日糧中添加α-半乳糖苷酶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肉仔雞的生長性能、能量和養(yǎng)分表觀代謝率及消化酶的活性均有顯著提高。

總之，α-半乳糖苷酶可有效降解飼料中存在的α-半乳糖苷等抗?fàn)I養(yǎng)因子，降低食糜黏度，減少幼齡動(dòng)物腹瀉發(fā)病率；可摧毀植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)釋放，提高利用效率；節(jié)省蛋白質(zhì)和合成氨基酸，提高瘦肉率；增強(qiáng)動(dòng)物的免疫功能和抗病能力，減少飼料中抗生素的用量；減輕或避免消化器官代償性增生和肥大，降低動(dòng)物維持需要量，提高飼料能量效價(jià)；擴(kuò)大飼料配方中原料使用種類，充分利用副產(chǎn)品等非常規(guī)飼料資源，降低配方成本等。

α-半乳糖苷酶還可用于糖類的合成。糖苷鍵的合成可以使用標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)合成方法，但通常需要一些繁瑣復(fù)雜的保護(hù)與去保護(hù)步驟。由于酶的穩(wěn)定性和低成本，通過酶法來合成顯示出很好的前景，但其主要缺點(diǎn)是可選擇性和產(chǎn)量都不高。α-半乳糖苷酶在造紙工業(yè)上也有一定應(yīng)用。阿拉伯木聚糖和半乳葡聚甘露聚糖是軟木中主要的半纖維素組分。α-半乳糖苷酶可以水解半纖維素類的半乳葡聚甘露聚糖，使α-半乳糖從其碳鏈骨架上分離下來。盡管單獨(dú)使用α-半乳糖苷酶處理造紙加工過程中的軟木紙漿對(duì)紙張的漂白無影響，但用木聚糖酶、甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶共同處理，則可以提高紙張的漂白效果。

β-半乳糖苷酶（EC 3.2.1.23）屬于糖苷水解酶，存在多種微生物來源，除了水解活性，某些來源的 β-半乳糖苷酶也具有轉(zhuǎn)糖基活性。來源不同的酶具有不同的特性，例如酶的最適 pH，最適溫度，動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km會(huì)有所區(qū)別。此外，酶的來源不同，如克魯維酵母、曲霉、芽孢桿菌、鏈球菌和隱球菌屬和不同的反應(yīng)條件，如溫度和 pH，酶反應(yīng)合成低聚半乳糖的聚合度、產(chǎn)率及形成糖苷鍵的類型也不同 。

β-半乳糖苷酶由β-半乳糖苷酶基因（LacZ 基因） 編碼，是由4 個(gè)亞基組成的四聚體，一般可催化乳糖分解為一分子的葡萄糖和一分子的半乳糖。從不同物種提取的β-半乳糖苷酶的蛋白質(zhì)序列有著較高的同源性和相似性。β-半乳糖苷酶的分子質(zhì)量在100~850 ku 之間，其中大腸桿菌的β-半乳糖苷酶分子質(zhì)量最大，為520~850 ku。目前，已有多種來源的β-半乳糖苷酶基因被克隆。

β-半乳糖苷酶的主要來源有：① 細(xì)菌、霉菌、酵母等微生物，其中細(xì)菌中的乳酸菌、大腸桿菌等，霉菌中的米曲霉、黑曲霉等，酵母中的脆壁克魯維酵母、乳酸克魯維酵母等，放線菌中的天藍(lán)色鏈霉菌等；② 植物，尤其是杏、扁桃和蘋果等；③ 哺乳動(dòng)物，特別是幼小哺乳動(dòng)物的小腸中。目前，僅來源于微生物的β-半乳糖苷酶有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值，商業(yè)用酶源一般認(rèn)為酵母（如乳酸克魯維酵母、脆壁克魯維酵母） 最為安全，其次為黑曲霉。

不同來源的β-半乳糖苷酶最適pH 在4.0~7.5之間不等。最適pH 不同決定了來源不同的β-半乳糖苷酶各自的用途不同，如霉菌所產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶的最適pH 偏酸性（pH 2.5~5.0），適用于酸性乳清和干酪的水解（含大量乳糖）；而酵母和細(xì)菌所產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶的最適pH 近中性（分別為pH 6~7 和pH 6.5~7.5），適于牛乳（pH 6.6）和鮮乳清（pH 6.1）的水解。β-半乳糖苷酶的最適作用溫度范圍較寬，在37~50 ℃之間。酵母β-半乳糖苷酶的最適作用溫度在35 ℃左右；而霉菌的最適作用溫度一般在50 ℃以上，最高可達(dá)60 ℃；環(huán)狀芽抱桿菌可達(dá)65 ℃；嗜熱水生菌則為80 ℃。耐高溫微生物菌株使用時(shí)可避免雜菌污染，所以細(xì)菌尤其是嗜熱細(xì)菌所產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶正得到廣泛的研究。迄今，大腸桿菌產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶研究得最徹底，并已大量應(yīng)用于生化分析 。

β-半乳糖苷酶除了能夠催化β-半乳糖苷化合物中的β-半乳糖苷鍵發(fā)生水解，還具有轉(zhuǎn)半乳糖基的作用。早期的研究表明，β-半乳糖苷酶上的活性位點(diǎn)有兩個(gè)功能團(tuán)：Cys 的巰基和His 的咪唑基，它們對(duì)β-半乳糖苷酶水解乳糖起重要作用。據(jù)推測(cè)，硫基可作為廣義酸使半乳糖苷的氧原子質(zhì)子化，而咪唑基可作為親核試劑進(jìn)攻半乳糖分子第1個(gè)碳原子上的親核中心，形成1 個(gè)含碳?xì)滏I的共價(jià)中間物。在被切割下咪唑基之后，巰基陰離子從水分子中抽取1個(gè)質(zhì)子，從而形成-OH 進(jìn)攻C。有研究認(rèn)為乳糖酶的催化機(jī)制與溶菌酶類似。當(dāng)半乳糖苷的受體是水時(shí)，發(fā)生的是水解；當(dāng)受體是另外的糖或醇時(shí)，則發(fā)生轉(zhuǎn)半乳糖苷作用；如受體是乳糖，則可以生成三糖的低聚半乳糖  。

目前β-半乳糖苷酶應(yīng)用的研究熱點(diǎn)主要集中在固定化、生產(chǎn)低聚糖和使用基因工程技術(shù)生產(chǎn)乳糖酶等方面  。

β-半乳糖苷酶在食品加工方面的應(yīng)用主要包括以下幾個(gè)方面：

1 解決乳糖不耐受患者的乳品消費(fèi)問題

世界上平均約70%~90%的成年人（尤其是亞洲和非洲人）喝牛奶后會(huì)因缺乏β-半乳糖苷酶不能降解牛奶中大量的乳糖而產(chǎn)生乳糖不耐受，我國乳糖不耐受癥的發(fā)生率為90%左右。用β-半乳糖苷酶水解牛乳中的乳糖，可將乳糖含量降低70%~80%，解決乳糖不耐受患者的乳品消費(fèi)問題。

2 用于提高乳制品的甜度

乳糖的甜度較低，只有蔗糖的20%，水解后1分子乳糖生成1 分子葡萄糖和1 分子半乳糖，可以明顯提高乳制品的甜度，減少甜味劑的用量。

3 防止乳制品冷凍時(shí)出現(xiàn)結(jié)晶

乳糖的溶解度較低，在制作冷凍乳制品時(shí)容易結(jié)晶析出，影響產(chǎn)品質(zhì)量。在加工中添加25%~30%的乳糖水解乳，可防止這類問題的出現(xiàn)。

4 生產(chǎn)低聚半乳糖

低聚半乳糖是以牛乳或乳清中的乳糖為底物，經(jīng)β-半乳糖苷酶催化生成的。低聚半乳糖的甜度為蔗糖的20%~40%，熱穩(wěn)定性較好，在酸性條件下也是如此，可作為雙歧桿菌增殖因子，促進(jìn)鈣質(zhì)吸收和有機(jī)酸生成、降低腸道pH、抑制外源菌生長和改善脂質(zhì)代謝。

5 應(yīng)用于發(fā)酵乳制品

用β-半乳糖酶水解乳制作酸乳比使用普通脫脂乳制備酸乳可以縮短乳凝固時(shí)間約15%~20%，且節(jié)省蔗糖用量，能改善酸乳的風(fēng)味和口感。另外，由于乳酸菌生長快，菌數(shù)多，還能延長酸乳的貨價(jià)期。

6 應(yīng)用于乳清加工

乳清中含有乳清蛋白、乳糖、礦物質(zhì)和維生素等營養(yǎng)成分，其中乳清蛋白是完全蛋白質(zhì)。世界年產(chǎn)乳清約為9×107 t，其中50%當(dāng)廢水排放，不僅造成浪費(fèi)，而且污染環(huán)境。用β-半乳糖苷酶將乳清中的乳糖水解，可去除乳清濃縮時(shí)乳糖結(jié)晶析出給加工帶來的不便。另外，用此水解物還可生產(chǎn)乳清飲料、糖漿和食品添加劑等。

7 分析乳制品中的乳糖含量

將精制的β-半乳糖苷酶和其它酶（如過氧化物酶、葡萄糖氧化酶）聯(lián)合使用，可以分析冰淇淋、干酪等乳制品中的乳糖含量。該法簡(jiǎn)便快捷，費(fèi)用低廉，可以在樣品不除去蛋白的情況下使用，適合在食品工業(yè)上應(yīng)用。

8 促進(jìn)果蔬軟化和成熟

β-半乳糖苷酶普遍存在于各種植物中，一般在植物成熟期β-半乳糖苷酶的含量增加，它能降解含半乳糖苷的胞壁多糖，釋放游離的半乳糖。可溶性半乳糖能促進(jìn)胡椒成熟，促發(fā)番茄乙烯生成加快成熟。目前，β-半乳糖苷酶已應(yīng)用于梨、蘋果、土豆、中國水粟等的軟化和番茄、胡椒、甜瓜、櫻桃、核果、牛油果等的促成熟。

β-半乳糖苷酶在免疫和檢測(cè)方面的應(yīng)用：

在免疫方面，Romanos 等將β-半乳糖苷酶與人體胞外淀粉狀蛋白前體融合形成融合蛋白，作為Alzheimer 病的免疫源，并進(jìn)一步制備了其單克隆抗體。在免疫檢測(cè)方面，β-半乳糖苷酶經(jīng)戊二醛一步標(biāo)記抗人IgG，建立了ELISA 測(cè)定程序，已用于人IgG、人群破傷風(fēng)抗體和單克隆抗體檢測(cè)，并已獲得了滿意的結(jié)果。同時(shí)還用于孕酮、皮質(zhì)醇半抗原標(biāo)記，初步建立了該酶的液相競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定程序。近年來，又有報(bào)道合成了該酶的大分子底物，因此β-半乳糖苷酶不僅可用作超微量熒光酶聯(lián)分析，而且還可以在酶放大免疫測(cè)定（EMIT）和底物標(biāo)記熒光分析（SLFI-A）中進(jìn)行應(yīng)用。在環(huán)境檢測(cè)方面，大腸桿菌β-半乳糖苷酶活性檢測(cè)可快速分析浴場(chǎng)和漁場(chǎng)地區(qū)海水水體受排泄物污染程度。

β-半乳糖苷酶基因在基因工程中的應(yīng)用：

目前，β-半乳糖苷酶基因被廣泛地應(yīng)用于包括作為報(bào)告基因、構(gòu)建載體、轉(zhuǎn)基因研究和基因治療等多個(gè)分子生物學(xué)研究領(lǐng)域。具體介紹如下：

1在載體構(gòu)建中的應(yīng)用

β-半乳糖苷酶可催化X-ga1（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷） 水解，產(chǎn)物呈藍(lán)色，易于檢測(cè)和觀察，基于這一特點(diǎn)，β-半乳糖苷酶基因常作為載體組分，廣泛地應(yīng)用于各類研究中?，F(xiàn)在分子生物學(xué)研究使用的許多克隆載體一般都具有一段大腸桿菌β-半乳糖苷酶的啟動(dòng)子及其α 肽鏈的DNA序列，可通過藍(lán)白選擇方便地篩選出陽性重組載體。

2 作為報(bào)告基因的應(yīng)用